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摘要: 研究了6种中草药对4种淡水鱼致病菌温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、生物Ⅰ-荧光假单胞菌和柱状黄杆菌的体外抑菌作用。以黄连、大黄、连翘、鱼腥草、厚朴和大青叶6种中草药的水提物为研究对象，采用滤纸片法检测其对4种致病菌的抑制活性，并分别测定了这6种植物提取物对供试菌的最小抑菌浓度( MIC) 。结果表明，黄连水提物对4种淡水鱼致病菌的抑菌效果最好，大黄和连翘水提物次之，而鱼腥草、厚朴和大青叶水提物的抑菌效果不明显。
关键词: 中草药； 淡水鱼致病菌； 抑菌圈； 最小抑菌浓度
温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、生物Ⅰ-荧光假单胞菌和柱状黄杆菌均是淡水养殖动物最常见的致病菌，其大量的繁殖给淡水鱼类养殖业带来巨大威胁。温和气单胞菌几乎危害所有的淡水鱼类，引起以败血症、腹泻等为主要症状的疾病；嗜水气单胞菌引起的慢性感染主要为溃疡病，表现为病灶红肿、发炎和出血，可导致草鱼的肠炎；生物Ⅰ-荧光假单胞菌是鱼类赤皮病的病原菌；柱状黄杆菌是中国重要养殖鱼类草鱼、金鱼、虹鳟和鳜等烂鳃病的病原。全球每年由于感染这些致病菌引起鱼类发病死亡所造成的经济损失极其严重。目前各类抗生素药物常被用于控制致病菌引起的疾病，然而，化学药物容易导致病原菌的耐药性、药物残留、影响水产品的安全且可能导致水环境受污染。采用中草药防止鱼病，不仅无残留、增强水产养殖动物的免疫力，有时还可能降低生产成本。该研究选取6种中草药制备成水提物，通过滤纸片扩散法测定其对温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、生物Ⅰ-荧光假单胞菌和柱状黄杆菌的体外抑菌作用，并分别测定了这6种植物提取物对供试菌的最小抑菌浓度(MIC) ，为暴发性鱼病的防治和新型饲料添加剂的开发提供科学依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株
温和气单胞菌CR79-1-1、嗜水气单胞菌XS91-4-1、生物Ⅰ-荧光假单胞菌W81-11和柱状黄杆菌G4均购于中国科学院水生生物研究所菌种保藏中心。
1. 1. 2 培养基
TSB培养基(加琼脂后为TSA) : 胰蛋白胨1.5%，大豆蛋白胨0.5%，氯化钠0.5%，琼脂1.5%，pH 7.3～7.5。粘菌培养基: 胰蛋白胨0.05%，酵母膏0.05%，牛肉膏0.02%，乙酸钠0. 02%，固体加琼脂2%，pH 7.2～7.4。
1. 2 方法
1. 2. 1 中草药水提物制备
试验所用的中草药为黄连、大黄、连翘、鱼腥草、厚朴和大青叶均购自云南省昆明市官渡区新兴中药材市场。粉碎过60目网筛，称取500g，加入蒸馏水5000ml，浸泡30min，煮沸后用温火再煮30min，收集滤液，重复3次，合并滤液，水浴蒸发浓缩至30ml，冷冻干燥成粉末，称质量，4℃保存待用。
1. 2. 2 菌悬液与滤纸片的制备
供试菌从4℃冰箱中取出后，接种于新鲜斜面培养基上，温和气单胞菌CR79-1-1、嗜水气单胞菌XS91-4-1和生物Ⅰ-荧光假单胞菌W81-11接种于TSA培养基，置于30℃恒温箱中培养48 h； 柱状黄杆菌G4接种于粘菌培养基上25℃恒温箱中培养72h活化后，用无菌生理盐水制备菌悬液。吸取1.00ml菌悬液加入9.00ml无菌生理盐水中，得到稀释10倍的菌悬液，采用二倍管法依次进行梯度稀释。将不同稀释度的菌悬液各吸取0.20ml分别加入至灭菌冷却的相应的平板培养基表面，涂布均匀，按上述条件培养。根据观察结果，选取各自适宜的菌液浓度，要求在该浓度下( 约为106cfu·ml-1 ) ，菌能长满整个培养皿且分布均匀。4 种菌接种浓度分别为CR79-1-1: 1.2 × 107cfu·ml-1，XS91-4-1: 2.6×107cfu·ml-1，W81-11: 2.5×107cfu·ml-1，G4: 5.4×107cfu·ml-1。
用打孔器将滤纸制成直径为6mm的圆片，放入干燥洁净的试管内，经121℃高压蒸汽灭菌20min，无菌条件下晾干备用。
1. 2. 3 滤纸片扩散法
将滤纸片分别浸入50mg·ml-1( 相当于各原药的质量分数: 黄连25%，大黄19%，连翘13. 9%，鱼腥草19%，厚朴13. 9%，大青叶13.9%) 的中草药水提物溶液中浸泡2h，用无菌镊子取出滤纸片逐个贴于倾注了温和气单胞菌、嗜水气单胞菌、生物Ⅰ-荧光假单胞菌和柱状黄杆菌菌悬液的培养基表面，每皿3片。以无菌水作为对照。置于各供试菌合适的恒温培养箱培养后，用游标卡尺测定抑菌圈直径，以抑菌圈直径作为提取物抑菌活性指标，直径越大抗菌活性越强。
1. 2. 4 MIC的测定
参照文献的方法进行改进，取供试药液与60℃的固体培养基10ml，配制15个质量浓度梯度( 4mg·ml-1、5mg·ml-1、6mg·ml-1、7mg·ml-1、8mg·ml-1、9mg·ml-1、10 mg·ml-1、11 mg·ml-1、12 mg·ml-1、13 mg·ml-1、14mg·ml-1、15mg·ml-1、16mg·ml-1、17 mg·ml-1和18 mg·ml-1 ) ，混合均匀待培养基凝固后，在培养基表面分别涂布0.1ml的4 种致病菌菌悬液，在相同条件下培养。观察是否有菌生长，平板无菌生长的记录该培养皿中倾注的提取物的浓度，即为该提取物的MIC。
2 结果
2. 1 6种中草药水提物对4种致病菌的抑菌活性
在相同浓度下，黄连、大黄、连翘水提物对4种致病菌均有抑菌作用，其中黄连、连翘、厚朴、大青叶水提物对柱状黄杆菌较其他3种菌的抑菌圈直径大，大黄水提物对柱状黄杆菌和嗜水气单胞菌的抑菌圈较对温和气单胞菌和生物Ⅰ-荧光假单胞菌大(表1) 。鱼腥草水提物对生物Ⅰ-荧光假单胞菌相对于其他3种菌的效果较好。
2. 2 6种中草药水提物对4种致病菌的MIC
黄连水提物对柱状黄杆菌的抑菌效果最好，其MIC值最小，对温和气单胞菌、嗜水气单胞菌和生物Ⅰ-荧光假单胞菌的效果也不错，其MIC值均不超过8mg·ml-1 (表2)；大黄、连翘水提物对柱状黄杆菌和嗜水气单胞菌的抑菌效果优于温和气单胞菌和生物Ⅰ-荧光假单胞菌； 鱼腥草水提物对生物Ⅰ-荧光假单胞菌的抑菌效果要优于对其他3种致病菌；厚朴水提物对温和气单胞菌的抑菌效果最差；大青叶水提物对生物Ⅰ-荧光假单胞菌的抑菌效果最差，其MIC值超过18 mg·ml-1。总体而言，黄连、大黄和连翘水提物对4 种致病菌的抑菌效果优于鱼腥草、大青叶和厚朴，其中黄连的抑菌效果最好。
表1 6种中草药水提物对4种致病菌体外抑菌圈直径
表2 6种中草药水提物对4种致病菌的MIC mg·ml–1
3 讨论
该研究以黄连、大黄、连翘、鱼腥草、厚朴和大青叶6种中草药水提物为研究对象，采用滤纸片法检测其对4 种致病菌的抑制活性。抑菌圈试验结果显示，对柱状黄杆菌有较强抑制作用的中草药水提物有黄连、大黄和连翘；对温和气单胞菌有较强抑制作用的有黄连和大黄；对嗜水气单胞菌有较强抑制作用的有黄连、大黄和连翘；对生物Ⅰ-荧光假单胞菌有较强抑制作用的有黄连和大黄。上述结果表明，黄连、大黄和连翘水提物可以作为潜在的预防和治疗柱状黄杆菌、温和气单胞菌、嗜水气单胞菌和生物Ⅰ-荧光假单胞菌的药物和饲料添加剂加以深入开发利用。
此外，笔者还进一步检测了黄连、大黄、连翘、鱼腥草、厚朴和大青叶6种中草药水提物对供试菌的MIC。结果表明，黄连水提物对4种致病菌的抑菌效果明显优于其他中草药水提物。研究表明，黄连对水产动物的致病菌有较强的抑菌作用，主要原因可能是因为黄连含有多种碱，如小檗碱、黄连碱和巴马汀等，其中以小檗碱含量最高，且抗菌活性最大。黄连水提物对4种致病菌的抑菌效果依次为柱状黄杆菌＞嗜水气单胞菌＞温和气单胞菌＞生物Ⅰ-型荧光假单胞菌，说明同一种中草药水提物对不同致病菌有不同的抑菌效果。有研究表明，对嗜水气单胞菌的体外抑菌效果是黄连＞连翘＞大黄＞鱼腥草＞大青叶，而此研究的结果是黄连＞大黄＞连翘＞大青叶＞鱼腥草，结果存在差异，其原因可能由于季节、产地及炮制方法等不同造成同一种中草药的有效成分含量差异较大从而导致药材质量的不稳定。
临床上发现，长期使用及滥用、错用抗生素等导致药物在鱼体组织中的残留现象普遍，同时，抗生素易导致细菌耐药菌株增加和耐药性增强，使用药量越来越大，药效越来越差。因此，鱼类一旦发生此类菌感染的疾病，病情很难得到理想控制，在今后的研究中有必要加大力度在中草药的抗菌机理、提取、加工及保存方法等方面，根据无公害养殖和健康养殖的特点开发具有高效、低副、无毒和使用方便等优点的复方中草药，真正发挥中草药在水产养殖动物细菌性疾病防治中的重要作用。
