FSI，口服干酪乳杆菌（Lactobacillus Casei）flaB蛋白重组疫苗可增强鲤鱼对维氏气单胞菌免疫能力
喻大鹏
今天给大家分享一篇FISH SHELLFISH IMMUNOLOGY的文章：口服干酪乳杆菌（Lactobacillus Casei）flaB蛋白重组疫苗可增强鲤鱼对维氏气单胞菌免疫能力，引用信息如下
doi.org/10.1016/j.fsi.2019.01.032
维氏气单胞菌（Aeromonas veronii）隶属于气单胞菌属，是一种典型条件致病菌，广泛分布于自然界中，具有高度传染性。近年来，有关A. veronii感染鱼病的报道越来越多，给水产养殖业带来巨大损失。研究表明，A. veronii具有强致病性，可以引起鲤鱼（Cyprinus carpio）大面积死亡。同时，有关A. veroni感染人致病的报道增多，说明A. veroni已然影响公共卫生安全。而接种疫苗是预防感染最佳方式之一。已有研究表明，A. veroni感染宿主致病，是由多种毒力因子参与破坏宿主免疫系统，其中包括：脂多糖（LPS）,外膜蛋白（OMPs），菌溶素（Aer），鞭毛蛋白等。鞭毛蛋白作为一种良好的免疫抗原，可以单独免疫宿主，促进细胞因子分化等特点；在免疫反应中起着关键作用，可以说是非常具有开发疫苗的潜力。Mohammad等人发现小鼠接种鞭毛蛋白疫苗，可以提高其细胞和体液免疫，这为鞭毛蛋白疫苗的开发提供理论依据。
粘膜免疫是机体整个免疫网络的重要组成部分，又是具有独特结构和功能的独立免疫体系。相比于传统免疫，粘膜免疫可以与外界抗原直接接触，产生高水平抗体，快速激活宿主T细胞，以及应激反应。而且，粘膜免疫非常适合预防动物之间大规模传染病。采用黏膜免疫法制备的鱼类口服疫苗比传统的注射疫苗更具优势。Zhang DX等人发现OmpAI蛋白在干酪乳杆菌（L. Casei）中表达可以提高鲤鱼感染A. veroni免疫力。乳酸菌作为益生菌，可以有效定植在肠道，缓慢释放抗原，是非常好的抗原传递介质。本文选取A. veroni 鞭毛flaB基因，作为免疫抗原蛋白；鲤鱼肠道分离L. CaseiCC16为抗原传递介质；同时构建表面展示抗原Lc-pPG-1-flaB和分泌抗原Lc-pPG-2-flaB质粒，检测两种flaB蛋白口服疫苗对鲤鱼感染维氏气单胞菌免疫能力的差异。
结果显示本文在L. CaseiCC16中成功表达表面展示抗原Lc-pPG-1-flaB和分泌抗原Lc-pPG-2-flaB（图1A），同时荧光显微镜下观察可见Lc-pPG-1-flaB（图1B左）和Lc-pPG（图1B右）成功电转入L. Casei。
连续传代L. Case50次，发现Lc-pPG-1-flaB和Lc-pPG-2-flaB可以稳定遗传（图2A）；连续培养5h，检测L. Casei分泌抗原蛋白Lc-pPG，Lc-pPG-1-flaB和Lc-pPG-2-flaB对其生长影响，结果显示抗原表达对L. Casei（图2B）生长无任何抑制作用。随后比较口服Lc-pPG-1-flaB，Lc-pPG-2-flaB和Lc-pPG 空载疫苗鲤鱼相比于PBS对照组，血清中flaB特异性IgM抗体变化情况，结果显示，随着免疫时间的变化，Lc-pPG-1-flaB和Lc-pPG-2-flaB实验组血清中flaB特异性IgM抗体显著升高（n=5，p<0.05）（图3）。
为确定Lc-pPG-1-flaB和Lc-pPG-2-flaB对C. carpio体液免疫影响，检测C. carpio血清酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)（图4），与对照组相比，28天后显著增强（n=5，p<0.05）。同时还发现，免疫28天后，相比于比Lc-pPG 和PBS对照组，实验组Lc-pPG-1-flaB和Lc-pPG-2-flaB血清中白细胞吞噬能力显著增强（图5）。
非常有趣的是，在不同时间点检测C. carpio免疫组织IL10（图6）, IL-1β（图7）,IFN-γ（图8）,TNF-α（图9）基因表达变化，发现Lc-pPG 和PBS并无差异，而Lc-pPG-1-flaB和Lc-pPG-2-flaB两组相比于PBS组，免疫基因表达量显著上升，但时间不同，这有可能与免疫基因在各组织中反应时间有关。
58天实验结束后，作者为检验Lc-pPG-1-flaB和Lc-pPG-2-flaB口服疫苗对鲤鱼感染维氏气单胞菌抗病力的影响，用200微升A. veroni（5✖106CFU/ml ）感染C. carpio（n=30），结果显示，Lc-pPG-1-flaB存活率为66.7%（图11），Lc－pPG－2－flaB存活率为（53．3％），显著高于对照组。flaB重组干酪乳杆菌可以定植到鲤鱼的肠道，并促进免疫应答、增强鲤鱼对气单胞菌感染的抗病性，从而产生较强的免疫保护作用。
讨论：本文验证了干酪乳杆菌作为抗原呈递载体通过口服给予鱼免疫。但是依然需要探索重组干酪乳杆菌免疫效力最佳条件和免疫剂量。需要进一步检验干酪乳杆菌作为口服疫苗的适用性。
